⑴ 雙酶 基因多少時間37度，或者說酶切時間過長還能用嗎，比如轉化什麼的
看你DNA量多少，酶量多少，DNA是否干凈。一般算好量，盡量把酶切時間控制在1-4小時之內，時間過長容易出現星號活性，或者連接效率降低等。
⑵ 雙酶切的問題
首先，你要確定你所切下來的目標條帶的分子量大小。如果切下來的片段分子量小的話（小於1kb)，經常會出現看不到的情況。因為從質粒上面切下來的片段摩爾數是和質粒一致的，在分子量很小的情況下，等摩爾數的小片段比質粒片段的質量要小很多，而一般的DNA染料（EB等）的熒光強度都是和質量呈線性關系的，所以很有可能因為片段質量太小而觀察不到。如從11kb的載體上雙酶切1kb的片段，那麼載體片段和切下的片段質量比就是10比1，那麼熒光強度也是10比1，如果你的原始酶切的質粒質量就不是很多，那麼切下的片段就會根本看不到。解決這個問題的方法就是加大原始酶切反應體系中的質粒的濃度或者電泳時提高上樣量。接著，還有一種可能就是兩種酶的酶切效率相差甚遠，一種酶活性非常好，一種酶則活性很弱，這樣就會產生看不到酶切片段的情況。而造成這種情況，一般都是通用buffer沒有選好，所以你要看兩種內切酶的說明書，選擇一種兩種酶都具有很好活性的buffer進行酶切。實在沒有很好的通用buffer，那麼你需要延長酶切時間。用單酶切不是不可以，但質粒自連的可能性會很大，這種情況下，你可以用鹼性磷酸酶處理後再進行連接，但自連可能性還是有的。醇沉法就是加入兩倍體積的乙醇，然後在－20或者-70中放置15-30min，接著進行短暫低速離心（1-2Min,5000 rpm左右），棄上清，然後乾燥。乾燥後加入適當的水或者TE溶解就OK了。醇沉法回收DNA片段效率會很低，所以你要預先多准備一些DNA。⑶ 質粒雙酶切純化產物-20存放3月還可以用嗎
這個由幾個方面的因素決定：
1.保存的酶切質粒是否經過純化，如果經過純化，比較容易保存
2.此酶切質粒是否經過反復凍融。如果頻繁多次凍融，DNA會比較容易降解，所以建議保存的時候能夠分裝凍存，每次取出一部分來，不反復凍融，保存會比較好
3.酶切質粒的濃度，通常濃度越高，質粒也會越穩定。以前我們實驗室做的pET載體，保存在-20C半年多都能用，就是做得很濃
4.為了保險起見，可以在連接前取一小部分載體去電泳看一下，有沒有降解，如果條帶清晰，亮度也理想的話，沒有問題，可以使用的。
⑷ 質粒上有BamHI,SalI 2個酶切位點,可以用BamHI,SalI雙酶切過夜嗎
。。。。。。
酶切的時間最好看看你所使用的酶的說明書，上面會有推薦的用法和使用的時間，這兩種酶所使用的緩沖液也要考慮到。當然，一般說明書喜歡吹吹牛皮，你最好問一下同實驗室有經驗的人員。
一般酶切質粒會比較好切，基本都不用過夜酶切，切得時間過長會有星號活性。
⑸ 酶切質粒
柱提取質粒後，未經酶切的正常狀態的應該有3個條帶，分別是共價閉合超螺旋DNA、開環DNA和線狀DNA，有時候會出現極淡的二聚體超螺旋帶。
雙酶切質粒後，要看你質粒上有幾個酶切位點來決定酶切後的帶型。但是你要首先保證你的質粒是被完全酶切的。如果你能保證完全酶切，那麼條帶數應等於你的酶切位點數。
⑹ 單酶切和雙酶切相比有何優缺點
質粒的構象；
限制性核酸內切酶；
質粒有三種構象：超螺旋、環狀和線性，在電場中，超螺旋構象的質粒移動最快；
限制酶會將雙螺旋斷開，即破壞了質粒的超螺旋結構，當你的雙酶切位點離的比較近時，會出現酶切後的質粒反而比超螺旋質粒跑得慢的現象。
1.對全基因組進行單酶切(保守序列已知，當然是保證保守序列不被酶切)
2.用連接酶讓片段隨意連接(切口一致，可能會環化)
3.設計保守序列兩端的反向引物
4.進行pcr擴增後跑膠，回收後測序，依次連接各個片段
一、GST pull-down實驗
基本原理：將靶蛋白-GST融合蛋白親和固化在谷胱甘肽親和樹脂上,作為與目的蛋白親和的支撐物,充當一種「誘餌蛋白」,目的蛋白溶液過柱,可從中捕獲與之相互作用的「捕獲蛋白」(目的蛋白),洗脫結合物後通過SDS-PAGE電泳分析,從而證實兩種蛋白間的相互作用或篩選相應的目的蛋白,「誘餌蛋白」和「捕獲蛋白」均可通過細胞裂解物、純化的蛋白、表達系統以及體外轉錄翻譯系統等方法獲得。此方法簡單易行,操作方便。註：GST即谷胱甘肽巰基轉移酶(glutathione S-transferase)
二、足印法（Footprinting）
足印法（Footprinting）是一種用來測定DNA-蛋白質專一性結合的方法，用於檢測目的DNA序列與特定蛋白質的結合，也可展示蛋白質因子同特定DNA片段之間的結合。其原理為：DNA和蛋白質結合後，DNA與蛋白的結合區域不能被DNase（脫氧核糖核酸酶）分解，在對目的DNA序列進行檢測時便出現了一段無DNA序列的空白區(即蛋白質結合區)，從而了解與蛋白質結合部位的核苷酸數目及其核苷酸序列。
三、染色質免疫共沉澱技術（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）
染色質免疫共沉澱技術（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是研究體內蛋白質與DNA相互作用的有力工具，利用該技術不僅可以檢測體內反式因子與DNA的動態作用，還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾以及轉錄因子與基因表達的關系。
染色質免疫沉澱技術的原理是：在生理狀態下把細胞內的DNA與蛋白質交聯在一起，通過超聲或酶處理將染色質切為小片段後，利用抗原抗體的特異性識別 反應，將與目的蛋白相結合的DNA片段沉澱下來。染色質免疫沉澱技術一般包括細胞固定，染色質斷裂，染色質免疫沉澱，交聯反應的逆轉，DNA的純化及鑒定。
四、基因晶元（又稱DNA 晶元、生物晶元）技術
基因晶元指將大量探針分子固定於支持物上後與標記的樣品分子進行雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號強度進而獲取樣品分子的數量和序列信息。通俗地說，就是通過微加工技術 ，將數以萬計、乃至百萬計的特定序列的DNA片段（基因探針），有規律地排列固定於2cm2 的矽片、玻片等支持物上，構成的一個二維DNA探針陣列，被稱為基因晶元。基因晶元主要用於基因檢測工作 。
基因晶元的測序原理是雜交測序方法，即通過與一組已知序列的核酸探針雜交進行核酸序列測定的方法，在一塊基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探針。當溶液中帶有熒游標記的核酸序列TATGCAATCTAG，與基因晶元上對應位置的核酸探針產生互補匹配時，通過確定熒光強度最強的探針位置，獲得一組序列完全互補的探針序列。據此可重組出靶核酸的序列。
五、高效液相色譜（HPLC）
高效液相色譜法是在經典色譜法的基礎上，引用了氣相色譜的理論，在技術上，流動相改為高壓輸送；色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高於經典液相色譜（每米塔板數可達幾萬或幾十萬）；同時柱後連有高靈敏度的檢測器，可對流出物進行連續檢測。
高壓泵將貯液罐的流動相經進樣器送入色譜柱中，然後從檢測器的出口流出，這時整個系統就被流動相充滿。當欲分離樣品從進樣器進入時，流經進樣器的流動相將其帶入色譜柱中進行分離，分離後不同組分依先後順序進入檢測器，記錄儀將進入檢測器的信號記錄下來，得到液相色譜圖。
⑺ 酶切片段的時間與酶切質粒的時間一樣嗎，或是短些還是長些
質粒為雙螺旋結構，當然比片段難切了，一般酶用量是片段的2-10倍，時間也要加長。
⑻ 為什麼質粒雙酶切後顯得更大了
線性化的跑得最慢。
質粒酶切後，和沒有酶切的對照相比。應該會多出一條帶，這條帶應該是跑得最慢的，也就是顯得比原來的更大。酶切的不徹底的話，原來的那幾條帶也可能存在wjswj(站內聯系TA)酶切之前你看到的應該是超螺旋，所以顯的比較小：）zbq-92(站內聯系TA)超螺旋的跑的最快，其次是線性的DNA，最後跑的最慢的是帶缺口（即開環）的。用鹼裂解法提取質粒看不到線性的帶，只有其餘的兩條，但不一定是那一條亮。
如果你的超螺旋那條特別亮，酶切後同樣大小的DNA片段，由於超螺旋變為線性，電泳就會顯示比超螺旋的帶大。
⑼ 質粒和基因連接時間過長會怎麼樣我都連了三天了~~
可能自連的情況概率有點高的，你的載體有篩選標記么，有的話，照樣做轉化，然後要記得pcr檢測或酶切檢測陽性克隆。
如果你是放4℃冰箱放了三天，關系應該不大；TA克隆的話，說不定效果更好。
⑽ 雙酶切的連接反應
1、回收PCR產物：
在進行PCR擴增時候，給引物兩端設計好酶切位點，一般說來，限制酶的 選擇非常重要，盡量選擇粘端酶切和 那些酶切效率高的限制酶，如BamHI，HindIII，提前看好各公司的雙切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。選好酶切位點後，在各個酶的兩邊加上保護鹼基。
雙酶切時間及其體系：需要強調的是很多人建議酶切過夜，其實完全沒有必要，我一般酶切3個小時，其實1個小時已經足夠。應用大體系，如100微升。
純化問題：純化PCR產物割膠還是柱式，我推薦柱式，因為割膠手法不準，很容易割下大塊的膠，影響純化效率。現在的柱式純化號稱可以祛除引物，既然如此，酶切掉的幾個鹼基肯定也會被純化掉了。所以，PCR產物和雙酶切產物的純化均可應用柱式純化。我用的是TAKARA的純化柱試劑盒
酶量的問題：以TAKARA的為例，其對1單位酶的定義如下：在50 μl 反應液中，37℃溫度下反應1小時，將1 μg 的λDNA完全分解的酶量定義為1個活性單位(U)。 而該酶濃度約為15單位/微升，在除外酶降解的 因素外，該酶可分解15μg的DNA，而一般從1-4ml菌液提出的 DNA約為3μg，而PCR純化後的產物（50體系）約為3μg，所以即便全部加進去，只要純化的 質量好，酶切完全切得動。
2、酶切、回收後的PCR產物與載體的連接
摩爾比的計算，很多人憑經驗也可以。但對於初學者從頭認真計算則 非常有必要。回收的載體片段：回收的PCR產物片段=1：3到1：10，一般取前者0.03pmol，後者取0.3pmol。
pmol為單位的DNA轉換為為μg單位的DNA：（X pmoles×長度bp×650）/ 1，000，000 （註：長度bp×650是該雙鏈DNA的分子量）所得數值即為μg，也可以直接用這個公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg，如載體是5380bp，則0.03pmol為
0.03×5.38×0.66=0.106524μg。
測DNA濃度測定可使用微量可見光分光光度計或者可以使用艾本德的BioPhotometer核酸蛋白分析儀，注意OD值，一般約1.7-1.9.的 說明寫的過夜，而其對連接酶單位的定義為：在20 μl的連接反應體系中，6 μg的λDNA-Hind III的分解物在16℃下反應30分鍾時，有90%以上的DNa段被連接所需要的酶量定義為1個活性單位（U）。而它的濃度為350 U/μl ，所以完全夠用。連接酶容易失活，注意低溫操作，最好在冰上。時間3個小時足已。
3、轉化：
a、一般轉化僅需要加入2 μl加入至100 μl 正常的TOP10感受態細胞中，冰浴放置30分鍾。
b、再在水浴中42℃熱激一般90～120秒鍾後，再在冰中放置3分鍾。
c、加入800 μl 無抗生素培養基，37℃全溫振盪搖床培養40分鍾。
取100μl塗布平板。一般轉化質粒不建議離心塗布（除非感受態效價特別低），
幾個非常重要的問題
1 做轉化質粒的時候一般不加連接酶。對PCR產物進行酶連接反應時，注意保持低溫狀態，因為T4連接酶長時間放置在常溫下容易活性降低，建議在冰盒中操作。
2 對含有AMP-RESISTENCE的質粒塗布時，一般培養基會放置在培養箱中一段時間後才會到感受態中，
3對照的設立：
為驗證雙酶切是否成功，可做如下對照：
A 酶切反應時加各單酶分別切，兩管，用同一種BUFFER，跑膠，看單切的兩管是否成線性.如兩管均成線性可初步判斷雙酶切成功.
做轉化時，也要進行對照.設4個：
A.即拿雙酶切的質粒產物也進行連接反應，這個對照可進一步看雙酶切是否成功，如果長出克隆，說明很有可能只進行了單酶切，如沒長出克隆，則證明雙酶切成功，當然要保證感受態，培基，連接酶都'正常'的情況下.
B.酶切過的未進行連接反應的雙酶切產物，進行轉化，這一步可以證明是否有殘留的未被任何酶切的原始質粒
C.設原始質粒為對照，意為檢測整個操作過程中是否有誤.
D.AMP陰性板上用同一批感受態細胞鋪板20微升足夠，檢測感受態狀況.
4.所有的試劑切記低溫保存.一步一個腳印.不要偷懶，圖省事最後卻更費事.注意設立對照。
經PCR鑒定，克隆90%-100%的陽性率，所以在後面的 挑克隆中，我只挑選4個就足夠了。然後雙酶切鑒定，測序。
