⑴ 双酶 基因多少时间37度，或者说酶切时间过长还能用吗，比如转化什么的
看你DNA量多少，酶量多少，DNA是否干净。一般算好量，尽量把酶切时间控制在1-4小时之内，时间过长容易出现星号活性，或者连接效率降低等。
⑵ 双酶切的问题
首先，你要确定你所切下来的目标条带的分子量大小。如果切下来的片段分子量小的话（小于1kb)，经常会出现看不到的情况。因为从质粒上面切下来的片段摩尔数是和质粒一致的，在分子量很小的情况下，等摩尔数的小片段比质粒片段的质量要小很多，而一般的DNA染料（EB等）的荧光强度都是和质量呈线性关系的，所以很有可能因为片段质量太小而观察不到。如从11kb的载体上双酶切1kb的片段，那么载体片段和切下的片段质量比就是10比1，那么荧光强度也是10比1，如果你的原始酶切的质粒质量就不是很多，那么切下的片段就会根本看不到。解决这个问题的方法就是加大原始酶切反应体系中的质粒的浓度或者电泳时提高上样量。接着，还有一种可能就是两种酶的酶切效率相差甚远，一种酶活性非常好，一种酶则活性很弱，这样就会产生看不到酶切片段的情况。而造成这种情况，一般都是通用buffer没有选好，所以你要看两种内切酶的说明书，选择一种两种酶都具有很好活性的buffer进行酶切。实在没有很好的通用buffer，那么你需要延长酶切时间。用单酶切不是不可以，但质粒自连的可能性会很大，这种情况下，你可以用碱性磷酸酶处理后再进行连接，但自连可能性还是有的。醇沉法就是加入两倍体积的乙醇，然后在－20或者-70中放置15-30min，接着进行短暂低速离心（1-2Min,5000 rpm左右），弃上清，然后干燥。干燥后加入适当的水或者TE溶解就OK了。醇沉法回收DNA片段效率会很低，所以你要预先多准备一些DNA。⑶ 质粒双酶切纯化产物-20存放3月还可以用吗
这个由几个方面的因素决定：
1.保存的酶切质粒是否经过纯化，如果经过纯化，比较容易保存
2.此酶切质粒是否经过反复冻融。如果频繁多次冻融，DNA会比较容易降解，所以建议保存的时候能够分装冻存，每次取出一部分来，不反复冻融，保存会比较好
3.酶切质粒的浓度，通常浓度越高，质粒也会越稳定。以前我们实验室做的pET载体，保存在-20C半年多都能用，就是做得很浓
4.为了保险起见，可以在连接前取一小部分载体去电泳看一下，有没有降解，如果条带清晰，亮度也理想的话，没有问题，可以使用的。
⑷ 质粒上有BamHI,SalI 2个酶切位点,可以用BamHI,SalI双酶切过夜吗
。。。。。。
酶切的时间最好看看你所使用的酶的说明书，上面会有推荐的用法和使用的时间，这两种酶所使用的缓冲液也要考虑到。当然，一般说明书喜欢吹吹牛皮，你最好问一下同实验室有经验的人员。
一般酶切质粒会比较好切，基本都不用过夜酶切，切得时间过长会有星号活性。
⑸ 酶切质粒
柱提取质粒后，未经酶切的正常状态的应该有3个条带，分别是共价闭合超螺旋DNA、开环DNA和线状DNA，有时候会出现极淡的二聚体超螺旋带。
双酶切质粒后，要看你质粒上有几个酶切位点来决定酶切后的带型。但是你要首先保证你的质粒是被完全酶切的。如果你能保证完全酶切，那么条带数应等于你的酶切位点数。
⑹ 单酶切和双酶切相比有何优缺点
质粒的构象；
限制性核酸内切酶；
质粒有三种构象：超螺旋、环状和线性，在电场中，超螺旋构象的质粒移动最快；
限制酶会将双螺旋断开，即破坏了质粒的超螺旋结构，当你的双酶切位点离的比较近时，会出现酶切后的质粒反而比超螺旋质粒跑得慢的现象。
1.对全基因组进行单酶切(保守序列已知，当然是保证保守序列不被酶切)
2.用连接酶让片段随意连接(切口一致，可能会环化)
3.设计保守序列两端的反向引物
4.进行pcr扩增后跑胶，回收后测序，依次连接各个片段
一、GST pull-down实验
基本原理：将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。此方法简单易行,操作方便。注：GST即谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase)
二、足印法（Footprinting）
足印法（Footprinting）是一种用来测定DNA-蛋白质专一性结合的方法，用于检测目的DNA序列与特定蛋白质的结合，也可展示蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合。其原理为：DNA和蛋白质结合后，DNA与蛋白的结合区域不能被DNase（脱氧核糖核酸酶）分解，在对目的DNA序列进行检测时便出现了一段无DNA序列的空白区(即蛋白质结合区)，从而了解与蛋白质结合部位的核苷酸数目及其核苷酸序列。
三、染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）
染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是研究体内蛋白质与DNA相互作用的有力工具，利用该技术不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰以及转录因子与基因表达的关系。
染色质免疫沉淀技术的原理是：在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，通过超声或酶处理将染色质切为小片段后，利用抗原抗体的特异性识别 反应，将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来。染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定，染色质断裂，染色质免疫沉淀，交联反应的逆转，DNA的纯化及鉴定。
四、基因芯片（又称DNA 芯片、生物芯片）技术
基因芯片指将大量探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。通俗地说，就是通过微加工技术 ，将数以万计、乃至百万计的特定序列的DNA片段（基因探针），有规律地排列固定于2cm2 的硅片、玻片等支持物上，构成的一个二维DNA探针阵列，被称为基因芯片。基因芯片主要用于基因检测工作 。
基因芯片的测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，在一块基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列TATGCAATCTAG，与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的序列。
五、高效液相色谱（HPLC）
高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送；色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。
高压泵将贮液罐的流动相经进样器送入色谱柱中，然后从检测器的出口流出，这时整个系统就被流动相充满。当欲分离样品从进样器进入时，流经进样器的流动相将其带入色谱柱中进行分离，分离后不同组分依先后顺序进入检测器，记录仪将进入检测器的信号记录下来，得到液相色谱图。
⑺ 酶切片段的时间与酶切质粒的时间一样吗，或是短些还是长些
质粒为双螺旋结构，当然比片段难切了，一般酶用量是片段的2-10倍，时间也要加长。
⑻ 为什么质粒双酶切后显得更大了
线性化的跑得最慢。
质粒酶切后，和没有酶切的对照相比。应该会多出一条带，这条带应该是跑得最慢的，也就是显得比原来的更大。酶切的不彻底的话，原来的那几条带也可能存在wjswj(站内联系TA)酶切之前你看到的应该是超螺旋，所以显的比较小：）zbq-92(站内联系TA)超螺旋的跑的最快，其次是线性的DNA，最后跑的最慢的是带缺口（即开环）的。用碱裂解法提取质粒看不到线性的带，只有其余的两条，但不一定是那一条亮。
如果你的超螺旋那条特别亮，酶切后同样大小的DNA片段，由于超螺旋变为线性，电泳就会显示比超螺旋的带大。
⑼ 质粒和基因连接时间过长会怎么样我都连了三天了~~
可能自连的情况概率有点高的，你的载体有筛选标记么，有的话，照样做转化，然后要记得pcr检测或酶切检测阳性克隆。
如果你是放4℃冰箱放了三天，关系应该不大；TA克隆的话，说不定效果更好。
⑽ 双酶切的连接反应
1、回收PCR产物：
在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的 选择非常重要，尽量选择粘端酶切和 那些酶切效率高的限制酶，如BamHI，HindIII，提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。
双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。
纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒
酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，37℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。 而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的 因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的 质量好，酶切完全切得动。
2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接
摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则 非常有必要。回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：3到1：10，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。
pmol为单位的DNA转换为为μg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1，000，000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为μg，也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg，如载体是5380bp，则0.03pmol为
0.03×5.38×0.66=0.106524μg。
测DNA浓度测定可使用微量可见光分光光度计或者可以使用艾本德的BioPhotometer核酸蛋白分析仪，注意OD值，一般约1.7-1.9.的 说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20 μl的连接反应体系中，6 μg的λDNA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNa段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为350 U/μl ，所以完全够用。连接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。时间3个小时足已。
3、转化：
a、一般转化仅需要加入2 μl加入至100 μl 正常的TOP10感受态细胞中，冰浴放置30分钟。
b、再在水浴中42℃热激一般90～120秒钟后，再在冰中放置3分钟。
c、加入800 μl 无抗生素培养基，37℃全温振荡摇床培养40分钟。
取100μl涂布平板。一般转化质粒不建议离心涂布（除非感受态效价特别低），
几个非常重要的问题
1 做转化质粒的时候一般不加连接酶。对PCR产物进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为T4连接酶长时间放置在常温下容易活性降低，建议在冰盒中操作。
2 对含有AMP-RESISTENCE的质粒涂布时，一般培养基会放置在培养箱中一段时间后才会到感受态中，
3对照的设立：
为验证双酶切是否成功，可做如下对照：
A 酶切反应时加各单酶分别切，两管，用同一种BUFFER，跑胶，看单切的两管是否成线性.如两管均成线性可初步判断双酶切成功.
做转化时，也要进行对照.设4个：
A.即拿双酶切的质粒产物也进行连接反应，这个对照可进一步看双酶切是否成功，如果长出克隆，说明很有可能只进行了单酶切，如没长出克隆，则证明双酶切成功，当然要保证感受态，培基，连接酶都'正常'的情况下.
B.酶切过的未进行连接反应的双酶切产物，进行转化，这一步可以证明是否有残留的未被任何酶切的原始质粒
C.设原始质粒为对照，意为检测整个操作过程中是否有误.
D.AMP阴性板上用同一批感受态细胞铺板20微升足够，检测感受态状况.
4.所有的试剂切记低温保存.一步一个脚印.不要偷懒，图省事最后却更费事.注意设立对照。
经PCR鉴定，克隆90%-100%的阳性率，所以在后面的 挑克隆中，我只挑选4个就足够了。然后双酶切鉴定，测序。
